سیتولوژی

نگاهی بر رنگ آمیزی و سیتولوژی در آزمایشگاه پاتولوژی

رنگ آمیزی اختصاصی (special staining )
بعضی نمونه ها علاوه بر    رنگ آمیزی روتین (هماتوکسیلین ائوزین) رنگ آمیزی اختصاصی هم میشوند.

گیمسا : در رنگ آمیزی:
1- لام خون محیطی (PBS )
2- آسپیراسیون مغز استخوان (BMA ) ،
3- لام بیوپسی معده( برای دیدن باکتری هلیکوباکترپیلوری ) ،
4- بیوپسی دئودنوم (در فردی که سوءجذب با عامل ژیاردیا دارد با علائم اسهال مزمن و دفع گاز) و
5- بیوپسی پوست مشکوک به عفونت سالک (لشمانیازیس)

پاس (PAS ) : در رنگ آمیزی:
1- بافت دارای عفونت با قارچ ها ( چون درغشا گلیکوژن دارند و با PASرنگ میگیرد)
2- غشا پایه( بخصوص در بیوپسی کلیه که ضخامت غشا پایه مهم است)
3- گلیکوژن داخل سلولی ( کبد ، کلیه، عضله اسکلتی و قلب و در بیماران مشکوک به ذخیره گلیکوژنی که دراین مورد خاص باید پاتولوژیست نمونه را نصف کند و یکی را با فرمالین 10% فیکس کند (فرمالین گلیکوژن را حل میکند) و نصف دیگر را با اتیلیک 96% (گلیکوژن حل نمیشود) ، سپس در آزمایشگاه نمونه فیکس شده با فرمالین را با هموتوکسیلین ائوزین و دیگری را با PAS رنگ میکنیم ( برای دیدن گلیکوژن).

PAS با Diastasis: زمانیکه دنبالقارچ در یک عفونت پوستی هستیم (ساختمان پوست یک اپی تلیوم سنگفرشی مطبق است و در سطح آن رشته های کراتین وجود دارد) وقتی با PAS رنگ کنیم ،سلول های سنگفرشی بدلیل وجود گلیکوژن به رنگ قرمز میشوند و قارچ و رشته های کراتین هم قرمز میشوند و در این صورت قارچ متمایز نمیشود بنابراین ابتدا توسط آنزیم آمیلاز(بزاق هم امیلاز دارد)گلیکوژن داخل سلول ها را از بین میبریم سپس رنگ PAS میکنند تا قارچ ها مشخّص شوند.

رنگ رتیکولین : رتیکولیت یکی از رشته های بافت همبند است و این رنگ برای بررسی وضعیت این رشته ها  بکار میرود که رنگ قهوه ای-سیاه میدهد مثلا در بیوپسی مغزاستخوان ( بیماری می یلو فیبروزیس که در مغز استخوان فیبروز ایجاد میشود و رشته های رتیکولین افزایش میابند و تولید سلول کاهش میابد) برای بررسی شدت افزایش رشته های رتیکولین و یارنگ آمیزی کبدی که بیماری  هپاتیت دارد.

رنگ تری کروم:رشته های کلاژن را به رنگ آبی در می آورد ( در عضله ، کلیه و  کبد دارایهپاتیت بکار میرود)

 

رنگ RED CONGO : برای رنگ آمیزی آمیلوئید (رسوب صورتی یکدست که در بیماران التهابی مزمن دیده میشود و برای اثبات اینکه این رسوب آمیلوئید است آنرا با RED CONGOO رنگ میکنند و برای دیدن آن از فیلتر پولاروید ( یکی روی چشمی و یکی روی منبع نور میگذاریم ) در صورت وجود رنگ سبز-زرد APPLE GREEN دیده میشود.

رنگ FE (رنگ پرل یا رنگ آهن ): رنگ آمیزی:

رسوب آهن در بافت ها ( مثل رسوب آهن در کبد  و  مغزاستخوان)
آسپیره مغزاستخوان (بررسی میزان ذخیره مغز استخوان که آهن بصورت دانه های آبی رنگ دیده میشود)
نکته : از بیوپسی B.M استفاده نمیشود زیرا هنگام نرم کردن در اسید آهن خود را از دست میدهد.

 

رنگ Zihel Neelsen :

برای مایکوباکتریوم ( اسید فست ها ) در خلط و…

نکته :حساسیت پایین است و نیاز به تعداد زیادی باسیل برای دیده شدن است .

 

رنگ Red Oil & Sudan black:

رنگ آمیزی چربی ،وقتی بیمار مشکوک به ذخیره چربی در بافت ها (طحال ، کبد ،لینفرود،سلول عصبی مغز و شبکیه)است (در این حالت سول ها باد میکنند ) نمونه را با فرمالین نمیتوان فیکس کرد زیرا چربی را حل میکند و فقط میتوانیم از روش  Frozen section استفاده کنیم و سپس از رنگ چربی استفاده میشود.

 

رنگ Mucicarmen: رنگ آمیزی موسین داخل سلولی که بیشتر در تشخیص تومور ها کاربرد دارد (قرمز و صورتی می شود) .

رنگ Elastin: رشته های الاستین را رنگ میکنیم مثلا درالتهاب جدار رگ ها ( vasculitis ) برای ثابت  کردن اینکه رشته های الاستیک جدار تکه تکه شدند .(رنگ تیره وسیاه می دهد).

رنگ Silver(نقره) : برای غشا پایه مثل PAS

 

موزه پاتولوژی : 

نمونه های جالب در فرمالین به مدت 20 تا 30 سال میتوانند بدون تغییر باقی بمانند.

آرشیو پاتولوژی :

در بخش پاتولوژی باید تمامی لام ها فایل شوند و حداقل بمدت 10 سال با سال و شماره بصورت مرتب آرشیو شوند که در صورت نیاز پزشک یا کارشناس به راحتی در دسترس باشند زیرا ممکن است پزشک بخواهد لام های یک بیمار را دربازه های زمانی مختلف مقایسه کند و یا در صورت اشتباه تشخیصی دوباره مراجعه شود.

سیتولوژی    (مطالعه سلول ها   )
نمونه مایعات بدن (مانند CSF، ادرار، سینویال ،مایع پری کارد،بزاق، آسیت و..) برای بررسی سیتولوژی (عمدتا برای بررسی سلول های بدخیم)به بخش پاتولوژی فرستاده میشوند.

شرایط فرستادن نمونه به بخش پاتولوژی: با سرنگ کشیده میشوند و بصورت مایع در ظرفی باید به سرعت به بخش فرستاده شود چون سلول ها زود خراب میشوند ، اگر نتوانستند سریع منتقل کنند باید نمونه را در ظرفی در بسته در یخچال نگهداری کنند البته راه دیگر آن است که هم حجم نمونه ، الکل اتانول 50% به نمونه اضافه کنیم اما الکل باعث سفت شدن سلول ها میشود بنابراین همان یخچال بهتر است .

همچنین مدت زمان بین جمع آوری و خراب شدن مایع به شرایط زیر بستگی دارد:

  1. PH مایع : هرچه PHمایع اسیدی تر باشد زودتر سلول ها خراب میشوند ( مثلا شیره معده باید در کنار یخ  نگهداری شود)
  2. پروتئین و  موکوس : هر چه بیشتر باشد سلول ها بهتر حفظ میشوند چون پروتئین  مثل محیط کشتی برای سلول است. ( مثلا ادرار و CSF پروتئین کمی دارند و زود خراب میشوند).
  3. فعالیت آنزیمی: هر چه بیشتر باشد سلول ها زودتر خراب میشوند.
  4. باکتری : هرچه باکتری موجود در نمونه بیشتر باشد مثل مایعات چرکی که باکتری و سلول های آماسی  موادی تولید میکنند  سلول هارا خراب میکند و دژنره میشود.

بعد از اینکه نمونه به بخش فرستاده شد :

  1. ابتدا توسط سانتریفیوژ رسوب تهیه میکنیم
  2. از رسوب آن لام تهیه میکنیم ( تعدادی لام تهیه کنیم)
  3. بلافاصله توسط الکل اتیلیک 96% فیکس میکنیم ( یادتان باشد هرگز در معرض هوا خشک نشود زیرا air drying سبب تغییر شکل سلول ها میشود)
  4. سپس میتوانیم لام را رنگ کنیم .

رنگ روتین در سیتولوژی پاپانیکولائو است که برگرفته از نام دکتر پاپانیکولائو است زیرا اولین بار در رنگ آمیزی اسمیر دهانه ی رحم این رنگ را ساخت واستفاده کرد.(اولین پاپ اسمیر نیز توسط این فرد تهیه شد)

نکته : اگر در مایع ارسالی ، لخته  و تکّه وجود داشت ، لخته یا تکّه  را برداشته و با آن لخته مانند بافت عمل می کنیم و مراحلی که برای بافت اجرا می کردیم برای آن اجرا می کنیم ( استفاده از فرمالین و تیشو پروسس و  تهیه بلوک سلولی و میکروتوم و تهیه لام و رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین و…. ).

Cell block : هر گاه لخته بافت مانندی در نمونه مایع یافت شد ، بسیار ارزشمند است و باید آنرا درون گاز استریل و سپس در فرمالین 10% گذاشته (24 ساعت) سپس به دستگاه Tissue processorr داده و بلوک و لام تهیه کرد و با هماتوکسیلین ائوزین رنگ کرد .

fine needle aspiration: FNA

مایعی که بصورت لام فیکس شده فرستاده میشود ؛ این نمونه با سرنگ از آب میان بافتی کشیده میشود و حجم کمی دارد و خود پزشک چندین لام از آن تهیه کرده و فیکس میکند و معمولا آنهارا روی یک مقوا میچسباند و به بخش پاتولوژی ارسال مینماید( لام ها نباید روی هم گذاشته شود ) .

نکته : ما باید تمامی لام های FNA ای که برایمان فرستاده میشود را رنگ کنیم ، چون ممکن است پراکندگی داشته باشد بنابراین تمامی لام ها رنگ و بررسی میشوند.

 

مایع BAL ( برونکو آلوئولار لاواژ) :نمومه مایعی که از شست شوی برونش و آلوئول بدست می آید.

 

cervicovaginal :Papsmear

نمونه ای که توسط سوآپ از دهانه رحم میگیرند .

لام پاپ اسمیر به دو روش تهیه می شود:

  • روش مرسوم (conventional) : در این روش ترشحات دهانه ی رحم را  برمیدارند و گستره تهیه میکنند و سپس با پاتوفیکس فیکس میکنند ( فاصله اسپری با لام باید 15 تا 20 cmm باشد ، اگر خیلی نزدیک باشد سلول ها پراکنده می شوند ).
  • روش بر پایه مایع (liquid base) :با برس نمونه برداری میشود ( بدین گونه سلول های بیشتری کنده میشوند) سپس برس را در محلولی مخصوص که فیکساتیو قرار داده و دسته اش را از محل مخصوص شکانده و درب ظرف را بسته و خوب تکان میدهند و سپس آنرا به دستگاه های سانتریفیوژ مخصوصی میدهند که خود دستگاه لام تهیه میکند ( لام هایی مخصوص که دارای دایره ی 2cm ای هستند و دستگاه سلول هارا در این دایره متمرکز میکند)سپس ما آنرا فیکس و رنگ آمیزی میکنیم.
    این روش برای همه مایع ها استفاده می شود اما در تهیه پاپ اسمیر شایع تر است.
    نکته : در بازار روش هایی ابداع شده که میتوان با سانتریفیوژ های معمولی هم از این روش استفاده کرد اما کیفیت بسیار پایین می آید.
    در روش اول(conventional) : همه سلول ها روی هم می افتند و معمولا سلول های التهابی روی سلول ها را میگیرند و تشخیص را سخت میکنند ، بدین ترتیب کیفیت وحساسیت این روش پایین است.
    در روش دوم (liquid base): سلول ها بصورت تک لایه قرار میگیرند و سلول های التهابی حذف میشوند و کیفیت بالایی دارد همچنین بدلیل اینکه سلول ها در دایره متمرکز میشوند ، تشخیص سریع تر انجام میشود.

 

سیتولوژی ادرار : بیشتر در موارد مشکوک به تومور مثانه و لگنچه درخواست میشود که معمولا در 3 نوبت ( ادرار دوّم اوّل صبح که از دیشب نبوده است ) گرفته میشود . نمونه حداقل باید 50 ccc باشد و به روش مرسوم و یا روش base liquid عمل میکنیم که در روش دوم با سانتریفیوژ رسوب تهیه کرده ورسوب 3 نوبت را در liquid ریخته و با استفاده از سانتریفیوژ مخصوص لام تهیه میکنیم .

  • نکته: voided urine  یعنی که به سوند وصل است ؛ در این حالت یابد قطرات تازه از سوند آمده را جمع آوری کرد ( از ادرار درون بگ استفاده نشود زیرا سلول ها خراب هستند) و باید حتما باید voided بودن ادرار گزارش شود چون سلول های بیشتری دارد.